Publication: Over kanser tedavisinde reseptör hedefli in siliko ligand tasarımının in vitro incelenmesi / In vitro investigation of receptor targeted in silico ligand design in ovarian cancer therapy
Files
Program
Authors
Authors
ŞENTÜRK, HİLAL
Advisor
AKBAŞ, FAHRİ
Date
Language
Type
Publisher
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Abstract
İnsan östrojen reseptör alfa (ERα), büyüme, metabolizma ve gelişimde rol oynayan östrojenle indüklenebilen birçok genin transkripsiyonunu düzenleyen bir nükleer reseptör ailesi üyesidir. ERα'nın dokularda aşırı ifade edilmesi ilişkili olduğu sinyal yollarını aktive etmesine neden olarak, hücrede DNA mutasyonlarının birikmesine, çoğalan hücrelerin neoplastik dönüşümüne ve tümörün ilerlemesine yol açar. Özellikle ERα ekspresyonu ve aktivasyonu hormona bağımlı kanser türlerinin gelişimi için birincil öneme sahiptir. Hormona bağımlı kanser tedavisinde ERα'yı hedefleyen çalışmalar, hücrelerde apoptozu uyarması ve epitelyal mezenkimal geçişi inhibe etmesiyle kanser tedavisinde uygun bir terapötik hedef olduğunu göstermiştir. Ancak endokrin tedavisine karşı zamanla gelişen direncin üstesinden gelebilmek için ERα'ya yönelik alternatif yaklaşımlar ligand bağlama alanınından çıkıp ERα-DNA veya ERα-kofaktör etkileşimleri (reseptör kutusunun (NR) LxxLL motifinin hidrofobik oyuk) üzerinde yoğunlaşmaktadır. Hedefli tedavilerde özellikle son yıllarda, terapötik peptitlerle, ERα-kofaktör etkileşimleri gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI) inhibe edilmesi hastalıkların tedavisinde genel bir strateji haline gelmiştir. Lineer peptit motiflerine göre farmakolojik açıdan daha yüksek performans gösteren, hedefe daha iyi bir afinite ile bağlanan kıstırılmış (siklik) peptitler, yeni ve hedefe yönelik inhibitörler olarak kapsamlı bir şekilde son yıllarda araştırılmaktadır. Bu yüzden bu tez çalışmasında; ERα'da yer alan çeşitli α-sarmal baskın protein-protein etkileşimlerini hedefleyen siklik peptitler, kofaktör bağlanma inhibitör bölgesi (LxxLL) baz alınarak tasarlanmıştır. Bu bölgeye özgü gerçekleştirilen in siliko çalışmalarımızda, ERα'ya bağlanan en kritik amino asitlerin kıstırılmadığı, aksine serbest bırakıldığı siklik peptit tasarımının mümkün olduğu gösterilmiştir. Bu sayede, yeni dizayn edilen siklik peptitler, ERα'ya hem özgün hem de biyoeşdeğerliği yüksek bir biçimde bağlanan, literatürde sunulan motiflere büyük bir üstünlük sağlayacak şekilde in siliko olarak hesaplanmıştır. Referans siklik peptit (SP1) ile tez kapsamında türetilen yeni siklik peptitler (SP2 ve SP3) Fmoc kimyası kullanılarak, katı-faz peptit sentez yöntemi ile sentezlenmiş ve DEAD yöntemi ile halkasallaştırılmıştır. Elde edilen lineer ve siklik ham peptitler LC-MS ile analiz edilip, karakterize edildikten sonra ters faz HPLC ile saflaştırılmış ve in vitro deneylerde kullanılmıştır. Tez çalışmasında ERα inhibitörü olarak TPBM ticari küçük molekülü, östrojen ile rekabet etmeden ERα'ya karşı peptitlerimiz ile benzer etki mekanizmasına sahip olduğu için referans molekül olarak kullanılmıştır. Gerçekleştirdiğimiz in vitro çalışmalar neticesinde tasarladığımız yeni siklik peptitlerin sadece aktif formadaki ERα (östrojen (E2) ile kompleks haline gelmiş) üzerinde etkili olduğu, E2'den yoksun ortamdaki siklik peptitlerin ERα (+) hücrelerinde herhangi bir etkisi olmadığı gözlemlendi. Bu durum siklik peptitlerin tasarımında, sadece ERα'nın aktif formunda açığa çıkan LxxLL motifine bağlandığının göstergesi olmuştur. Aynı zamanda E2 ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında SP'lerin ERα eksprese etmeyen kanser ve sağlıklı hücre hatlarında herhangi bir toksik etki gösterememiş sadece ERα eksprese eden hücreler üzerinde antiproliferatif etki göstermiş olması, peptitlerin ERα üzerinden hücre büyümesini inhibe ettiğini desteklemiştir. Ayrıca oluşturulan peptit kombinasyonlarının hücre hatları üzerinde antiproliferatif ve toksik etki gösterdiği hücre canlılık testleri vasıtasıyla belirtilmiştir. En etkili kombinasyon grubun SP2 + SP3 ve SP1 + SP2 + SP3'ün hücrelerin ERα ile ilişki yolaklarında ve önemli apoptoz belirteçleri üzerindeki etkisi de hem gen hem de protein bazında açığa çıkarılmıştır. qPCR ve Western Blot'tan elde edilen veriler içsel apoptoz yolunda rol oynayan p53, p21, Bax ve Bcl-2 'nin yanı sıra dışsal apoptoz yolunda rol oynayan kaspaz-8'in değişen ekspresyon profilleri hücrelerin siklik peptit kombinasyon tedavasi sonrası her iki apoptoz yolu üzerinden etkileyebileceğini göstermiştir. Yapılan akış sitometrisi analizleri ile etkili kombinasyonlarla tedavi edilen hücrelerdeki kaspaz 3/7 aktivitesinin artışı ile Annexin V belirteçlerinin aşırı ifadesi hücreleri yoğun olarak erken ve geç apoptoza sürüklediğini desteklemiştir. Bunlara ilateven, Bcl-2 ekspresyonunun ve mitokondriyel membran bütünlüğünün ölçüldüğü akış sitometrisi analizlerinde siklik peptit kombinasyon tedavisi sonrasında hücrelerde Bcl-2 inaktivasyonun ve mitokondiryel memebran bütünlüğü bozulmuş hücre sayısındaki anlamlı artışlar Bcl-2 sinyal yolunun etkisiz hale getirildiği ve apoptozun mitokondri yoluyla gerçekleştiğini kanıtlamıştır. Ayrıca hücrelere sadece peptit ve peptit kombinasyonları uygulandıktan sonra hücre içinde dağılım gösteren sitoplazmik ve nükleer ERα aktivasyonlarında düşüşün meydana gelmesi siklik peptitlerin ERα'ya spesifik olduğunu kanıtlar nitelikte olmuştur. Buna ek olarak, MCF-7 hücrelerinin proliferasyonunda önemli bir rolü üstlenen hatta hormon direnci ile güçlü bir ilişkisi bulunan sitoplazmik ERα'nın, siklik peptit tedavisinden sonrasında aktivitesinin çarpıcı bir şekilde azalmasının apoptozun bu yolak üzerinden indüklediği ilgi çekici bir bulgu olarak elde edilmiştir. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, ERα hedeflemesi için siklik peptitler tasarlanmış, sentezlenmiş ve ERα(+) hücreleri üzerindeki inhibitör etkisi çeşitli in vitro çalışmalarla desteklenmiştir. Sonuçlarımızda siklik peptitlerin hücrelerin hem içsel hem de dışsal apoptoz yolunda etkili olarak hücrelerin ölüm mekanizmalarını indüklediği sunulmuştur. Bu tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni siklik peptitlerin, yeni teknolojilerle daha da iyileştirilmesinin mümkün olduğunu ve hali hazırdaki klinik tedavilere alternatif ya da yeni peptit kombinasyon tedavilerinin oluşturulmasında yardımcı bir yaklaşım olabileceğini göstermekteyiz.
Description
Human estrogen receptor alpha (ERα) is a nuclear receptor family member that regulates the transcription of many estrogen-inducible genes involved in growth, metabolism, and development. Overexpression of ERα in tissues activates its associated signaling pathways, leading to the accumulation of DNA mutations in the cell, neoplastic transformation of proliferating cells, and tumor progression. ERα expression and activation are of primary importance for developing hormone-dependent cancers. Studies targeting ERα in hormone-dependent cancer therapy have shown that it is a suitable therapeutic target in cancer treatment by inducing cell apoptosis and inhibiting epithelial-mesenchymal transition. However, to overcome the resistance to endocrine therapy that develops over time, alternative approaches to ERα are moving away from the ligand binding domain and focusing on ERα-DNA or ERα-cofactor interactions (the hydrophobic groove of the LxxLL motif of the receptor box (NR)). In targeted therapies, especially in recent years, the inhibition of protein-protein interactions (PPIs), such as ERα-cofactor interactions by therapeutic peptides, has become a general strategy for treating diseases. Cyclic peptides, which bind to the target with a better affinity and perform pharmacologically better than linear peptide motifs, have been extensively investigated as novel and targeted inhibitors in recent years. Therefore, in this thesis, cyclic peptides targeting various α-helix-dominant protein-protein interactions in ERα were designed based on the cofactor binding inhibitor region (LxxLL). Our in silico studies have shown that it is possible to design cyclic peptides in which the most critical amino acids binding to ERα are not restricted but instead released. In this way, newly designed cyclic peptides have been calculated in silico that bind to ERα in a unique and highly bioequivalent manner, providing a major advantage over the motifs presented in the literature. The reference cyclic peptide (SP1) and the novel cyclic peptides derived in this thesis (SP2 and SP3) were synthesized by solid-phase peptide synthesis method using Fmoc chemistry and cyclized by DEAD method. The obtained linear and cyclic crude peptides were analyzed and characterized by LC-MS, purified by reverse phase HPLC, and used in in vitro experiments. In the thesis study, the TPBM commercial small molecule was used as a reference as it has a similar mechanism of action with our peptides against ERα without competing with estrogen as an ERα inhibitor. As a result of our in vitro studies, it was observed that the new cyclic peptides we designed were only effective on ERα (complexed with estrogen (E2)) in the active form, while cyclic peptides in E2-deprived medium did not affect ERα (+) cells. This indicated that the cyclic peptides design binds only to the LxxLL motif exposed in the active form of ERα. At the same time, in an E2-supplemented cell culture medium, SPs did not show any toxic effect on cancer and healthy cell lines that do not express ERα but only showed the antiproliferative effect on ERα-expressing cells, supporting that the peptides inhibit cell growth via ERα. In addition, the antiproliferative and toxic effects of the peptide combinations on cell lines were indicated by cell viability tests. The effect of the most effective combination group, SP2 + SP3 and SP1 + SP2 + SP3, on ERα-related pathways and important apoptosis markers of cells was determined at both the gene and protein level. The data obtained from qPCR and Western blot showed that the altered expression profiles of p53, p21, Bax, and Bcl-2, which are involved in the intrinsic apoptosis pathway, as well as caspase-8, which is involved in the extrinsic apoptosis pathway, showed that the cells were affected through both apoptosis pathways after cyclic peptide combination therapy. Flow cytometry analyses showed that increased caspase 3/7 activity and over-expression of Annexin V markers in cells treated with the effective combinations intensely drove the cells to early and late apoptosis. In addition, flow cytometry analysis of Bcl-2 expression and mitochondrial membrane integrity showed that Bcl-2 inactivation and significant increases in the number of cells with impaired mitochondrial membrane integrity after cyclic peptide combination treatment supported that the Bcl-2 signaling pathway was inactivated and apoptosis occurred through mitochondria. In addition, the decrease in cytoplasmic and nuclear ERα activations distributed in the cell after treatment of cells with only peptides and peptide combinations proved that cyclic peptides were specific for ERα. In addition, cytoplasmic ERα, which plays an important role in the proliferation of MCF-7 cells and has a strong relationship with hormone resistance, decreased dramatically after cyclic peptide treatment, indicating that apoptosis is induced through this pathway. In conclusion, within the scope of this thesis, cyclic peptides for ERα targeting were designed and synthesized, and their inhibitory effect on ERα (+) cells was supported by various in vitro studies. The results show that cyclic peptides induce cell death mechanisms by acting on both the cells' intrinsic and extrinsic apoptosis pathways. It has been demonstrated that the new cyclic peptides we have developed within the scope of this thesis can be further improved with the latest technologies and can be an alternative to current clinical treatments or a helpful approach to creating new peptide combination therapies.