Publication: Development of whole blood stage vaccine for malaria treatment via CRISPR-gene editing technology / CRISPR-gen düzenleme teknolojisi ile sıtma tedavisinde kullanılacak canlı zayıflatılmış kan evresi aşısı geliştirilmesi
Loading...
Files
Date
Authors
Authors
DEVECİ, GÖZDE
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Metrics
Abstract
Sıtma insanlık tarihinin ilk yıllarından beri özellikle gebe ve çocukları etkileyen ve binlerce insanın ölümüne yol açmış başlıca küresel sağlık problemlerinden biridir. Sıtma tedavisinde karşılaşılan en büyük zorluk sıtma ilaçlarına karşı gelişen ilaç direncidir. Sıtmanın yok edilebilmesi için aşılama en güvenilir ve önemli yöntemlerden biridir. Ancak sıtma tedavisinde kullanılacak mevcut bir aşının bulunmadığı ve geliştirilen alt birim aşı adayları etkinliğinin % 0-30 arasında olduğu rapor edilmiştir. Diğer yandan, deneysel aşılamalarda kullanılan canlı zayıflatılmış aşıların steril bağışıklığı indüklediği gösterilmiştir. Ancak gen düzenleme teknolojilerinin yetersiz olması canlı zayıflatılmış aşıların geliştirilmesini sınırlamaktadır. İnsan sıtma türünde nucleosit transport gen ailesinin 4 üyesi (NT1, NT2, NT3 ve NT4) tanımlanmıştır ve her bir aile üyesinin konakçıdan pürin alımında rol oynadığı düşünülmektedir. Bu tez çalışmasında nucleosit transport 1 geni P. yoelii ve P. berghei suşlarından CRISPR-Cas9 gen düzenleme yöntemiyle silinmiştir. CRISPR-Cas9 teknolojisi, çeşitli canlı organizma genlerinin düzenlenmesinde kullanılmaktadır. CRISPR-Cas9 teknolojisi homolog rekombinasyon temelli gen hedefleme yöntemini geliştirmede ışık tutmaktadır. Bu çalışmada ayrıca üretilen nükleosit transport 1 geni silinmiş parazit suşları ile karışık doz canlı zayıflatılmış kan evresi sıtma aşısı modeli geliştirilmiştir. Eşit miktarda Pbnt1(-) ve Pynt1(-) parazitleri karıştırılarak taze ya da dondurulmuş formda oluşturulan aşılar tek doz subkutan yolla farklı fare gruplarına injekte edilmiştir. Ardından aşının etkinliği yabanıl tür P. berghei ANKA ve P. yoelii 17-XNL ile intravenöz olarak injekte edilerek incelenmiş ve steril koruma gözlemlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, genetik yöntemlerle zayıflatılmış iki farklı parazit türünün tek doz deri altı subpatent injeksiyonunun insanlarda da iki farklı türdeki sıtma infeksiyonuna karşı koruyucu olabileceğini düşündürmektedir. NT1 geni silinmiş parazitler pürin içeren kültürlerde üretilebilir ve endemik bölgelere dondurulmuş dozlar olarak sıvı nitrojen içinde gönderilebilir. Bu tezde ayrıca nükleosit transport 4 geninin plazmodium yaşam döngüsündeki rolü potansiyel sıtma aşı hedefi olarak incelenmiştir. NT4 nakavt P. berghei parazitleri üretilmiş, bu parazitlerin kan evresindeki gelişiminde belirli bir farklılık görülmemiştir. Ancak, sporozoitlerin ookistlerden çıkışı ve tükrük bezini istilasında bir kısıtlanma gözlemlenmiştir. Ayrıca, tükrük bezi ve hemolenften toplanan Pbnt4(-) sporozoitlerinin infeksiyona sebep olmadığı belirlenmiştir. Sonuç olarak gelecekteki NT4 geni sıtma transmisyon blokaj çalışmaları için umut vaadedicidir.
Description
Malaria remains a major global health problem among mainly in pregnant women and children, which resulted in death of hundreds of thousands of humans. One of the greatest challenges for malaria treatment is drug resistance against antimalarial drugs. Therefore, eradication of malaria can only be achieved with the application of very potent and safe vaccines. However, there is no malaria vaccine currently available, and the most advanced subunit vaccine candidate has recently reported efficacy between 0-30% against clinical malaria cases. On the other hand, live attenuated whole parasites used in experimental vaccination trails induced complete sterile protection. However, the inefficiency of gene editing technologies has limited their use in generating live attenuated vaccines. Four members (NT1, NT2, NT3, and NT4) of the nucleoside transporter gene family play an important role in the purine transfer from the host to human malaria parasites. In this thesis, we developed nucleoside transporter 1 deficient Plasmodium yoelii and Plasmodium berghei via CRISPR-Cas9 gene editing methods. The CRISPR/Cas9 system is an emerging genome-editing technology that is used to edit the gene for various living organisms. CRISPR/Cas9 system sheds light on Plasmodium (P. yoelii, P. falciparum, etc.) to modify the targeted genes based on homologous recombination. We also generated a mixed live attenuated blood-stage malaria vaccine model using that NT1 deficient plasmodium strains. Equally mixed Pbnt1(-) and Pynt1(-) parasites in single subcutaneous fresh or frozen doses were injected in a group of mice and conferred sterile protection against intravenous infectious blood-stage challenge with wild-type parasites of P. berghei ANKA and P. yoelii 17X-NL strains. This data may indicate that a single subcutaneous sub-patent dose of two species of genetically-growth-attenuated parasites, can protect humans against two Plasmodium spp. infections. NT1 knockout parasites could be developed in cultures provided with supra-physiological concentrations of purine and shipped to endemic areas in frozen-stock doses stored in liquid nitrogen. In this thesis, we also evaluated the role of the nucleoside transporter 4 gene (NT4) in the Plasmodium life cycle as a potential malaria vaccine target. Herein, NT4 deficient P. berghei parasites were generated, and in the erythrocytic stage, significant differences have not been observed. However, oocyst egress and sporozoite invasion of salivary glands are restricted in the mosquito stage. Moreover, the Pbnt4(-) salivary glands and hemolymph sporozoites did not develop infectivity. As a result of these results, the NT4 gene could be a promising target for the next malaria transmission-blocking studies.
Keywords
Malaria, Plasmodium berghei, Plasmodium yoelii, CRISPR-Cas9, Bloodstage vaccine, Nucleoside Transporter 1, Nucleoside Transporter 4