Expression of bioactive peptide Lunasin in Aspergillus oryzae: antioxidant properties and biotechnological prospects

Abstract

Lunasin, doğal bitkilerden elde edilen biyoaktif bir peptittir ve anti-kanserojen, anti-inflamatuar ve antioksidan özelliklere sahiptir. Mevcut elde etme yöntemleri; doğal kaynaklardan izolasyon, kimyasal sentez ve rekombinant yöntemlerle üretimdir. Geleneksel izolasyon yöntemleri emek yoğun ve kaynak tüketimine dayalıyken, kimyasal sentez maliyetlidir ve çevre dostu olmaktan uzaktır. Bu çalışma, lunasin\"in Aspergillus oryzae\"de ekspresyonunu optimize etmeyi, ekonomik olarak yüksek verim elde etmeyi ve özellikle in vitro antioksidan etkinliğine odaklanmayı amaçlamaktadır. Kullanılan ekspresyon vektörü, amilaz ile birleştirilmiş dört tekrarlanan lunasin dizisini içermektedir ve rekombinant proteinin belirlenmesi ile saflaştırılmasında yararlanmak amacıyla bir His-etiketi dizi sonuna entegre edilmiştir. Ekspresyon vektörü, protoplast aracılı transformasyon yoluyla pyrGoksotrofik A. oryzae\"ye aktarılmış ve elde edilen rekombinant protein metal afinitesi kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Rekombinant proteinin saflığı SDS-PAGE, Western Blot ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) yöntemleri ile doğrulanmıştır. Lunasin\"in lipit peroksidasyonunu inhibe etme yeteneği linoleik asit analizi ile gösterilirken, radikal süpürme aktivitesi ABTS analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. SDS-PAGE analizleri, A. oryzae\"nin lunasin\"i amilaz ile füzyon halde ve amilazdan bağımsız (füzyon olmayan) olmak üzere iki farklı şekilde ifade ettiğini göstermiştir. Western Blot analizleri, lunasin\"in hem füzyon hem de füzyon olmayan formlarının sürekli ifadesini doğrularken, SEC analizi her iki varyantın da stabilitesini koruduğunu doğrulamıştır. İn vitro antioksidan etkinlik açısından, 0.1 μM füzyon olmayan lunasin, 4 ve 72 saatte lipit peroksidasyonunu azaltmada α-tokoferol ve BHA\"ya kıyasla üstün performans sergilemiştir. Benzer şekilde, füzyon olmayan lunasin anlamlı derecede ABTS süpürme aktivitesi gösterirken, füzyon Lunasinin etkinliği anlamlı ölçüde bulunmamıştır. Sonuçlar füzyon olmayan lunasinin, füzyon lunasine kıyasla dikkate değer antioksidan etkinlik gösterdiğini belirtmektedir. Bu çalışma, çözünebilir formda lunasin üretiminde A. oryzae’nin kullanıldığı ilk çalışmadır ve biyoteknolojik uygulamalarda antioksidan işlevli biyoaktif peptitlerin A. oryzae’de üretim potansiyelini ortaya koymaktadır.Lunasin, a bioactive peptide sourced from natural plants, exhibits anti-carcinogenic, anti-inflammatory, and antioxidant properties. Lunasin is currently produced through natural sources, chemical synthesis, and recombinant methods. Traditional isolation methods are labor-intensive and resource-demanding, while chemical synthesis is costly and environmentally unfriendly.This study aims to optimize the expression of lunasin in Aspergillus oryzae to achieve high yields, economically, with a particular focus on its antioxidant efficacy in vitro. In this study, the lunasin expression vector included four repeated lunasin sequences fused with amylase, incorporating a His-tag for detection and purification. This construct was introduced into pyrG auxotrophic A. oryzae via protoplast-mediated transformation, and the resulting protein was purified using metal affinity chromatography. Its composition and purity were assessed through SDS-PAGE, Western Blot, and size-exclusion chromatography (SEC). The ability of lunasin to inhibit lipid peroxidation was demonstrated through a linoleic acid assay, and its radical scavenging activity was evaluated using an ABTS assay. SDS-PAGE analyses showed that A. oryzae expresses the lunasin in two distinct forms: one fused with amylase and the other without fusion with amylase. Western blot analyses confirmed sustained expression of both fusion and non-fusion forms of lunasin. SEC analysis validated the stability of both variants. In terms of in vitro antioxidant efficacy, 0.1 μM non-fusion lunasin exhibited superior performance compared to α-tocopherol and BHA in reducing lipid peroxidation at 4 and 72 hours. It also exhibited significant ABTS scavenging activity, unlike fusion lunasin. Non-fusion lunasin displayed notable antioxidant efficacy compared to fusion lunasin. This study demonstrated for the first time the efficient production and secretion of soluble lunasin by A. oryzae, highlighting its potential to produce functional bioactive peptides with antioxidant benefits for biotechnological applications.