Publication: Poli Laktik-ko-Glikolik Asit Nanopartikülleri Kullanarak Hedefli Hücrelerde RNA İnterferans ile Gen Susturma Yöntemi Geliştirilmesi
Loading...
Files
Date
2019
Authors
Authors
Ceylan, Şeyma
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Bezmialem Vakıf University
Metrics
Abstract
Pancreatic cancer is considered among the highest cancer incidence and mortality in the world and in Turkey. These data indicate that existing treatment strategies are not sufficiently effective. In spite of developed modern methods, pancreatic cancer, can be treated with surgical methods only. In addition, chemotherapy drugs used for therapeutic purposes can not target the tumor and have a harmful effect on healthy tissues; these methods have several disadvantages, such as radiotherapy used for therapeutic purposes, resulting in loss of function in healthy tissue exposed to radiation. Traditional treatment methods for cancer treatment are replaced by new generation therapies specific to the tumor. Targeted therapies are of great interest of scientific authorities as they do not harm healthy cells and have high selectivity to the tumor tissue. The RNA interference (RNAI) technique is a natural, biological process in which gene expression is inhibited as a result of the destruction of specific mRNA molecules that are complementary to the cytoplasm of the single strand of double stranded miRNA encoded by DNA in the nucleus. The binding of antisense-acting molecules to the target mRNA inhibits the expression of the gene. In the RNAi mechanism, a variety of molecules such as microRNA (miRNA) and small interfering RNA (siRNA) are used which exhibit an antisense effect. Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles; used for diagnosis and treatment of cancer; shows superior properties such as characteristic biodegradability, high biocompatibility, low toxicity compared to other nano drug delivery systems. It is possible to silence the gene at the level of mRNA with the siRNA loaded into the PLGA nanoparticles. The GPR87 (G protein-coupled receptor 87) gene is the gene encoding the cell surface receptor included in the GPCR (G protein-coupled receptors) family. The GPR87 gene, which is overexpressed in pancreatic cancer, plays an important role in maintaining the viability of cells. Silencing of the gene using the GPR87 gene, siRNA-loaded PLGA nanoparticles, significantly affects the survival of the cells. In this study, the GPR87 gene was targeted by PLGA nanoparticles in different cells, and the gene was aimed to be post transcribed by the RNAi mechanism. For this purpose, the GPR87 gene was isolated from the HEK293T cell line, and the gene isolated polymerase chain reaction (PCR) amplification was performed with the gene-specific primers. The PCR product and the psiCHECK2 vector were ligated by XhoI. The GPR87- psiCHECK ™ -2 recombinant vector was transformed into E. coli One Shot® Mach1 ™ -T1R cells. Transformation control was controlled by PCR, agarose gel electrophoresis and bioinformatics. Then, the generation of siRNA specific to the GPR87 gene sequence was performed. The first generation of siRNA production was carried out by the oligonucleotide template design. After hybridization with this template T7 promoter primer was achieved, polymerization with Klenow DNA polymerase was performed to obtain dsRNA. In the second stage of the thesis, the synthesis, characterization, optimum release time and toxicity of PLGA nanoparticles were determined. For this purpose, PLGA nanoparticles were first prepared by water-oil-water (W1 / O / W2) double emulsion solvent evaporation method. Using different techniques, nanoparticles were prepared in three different formulations and siRNA was loaded into these nanoparticles. Characterization of the obtained siRNA-PLGA nanoparticles were performed, and the efficiency of the Encapsulation efficiency (% EE) and loading efficiency (LE) were calculated. In addition, the in vitro release process of the generated nanoparticles was optimized and cytotoxicity was measured. In the final stage, the gene silencing caused by nanoparticles at human embryonic kidney cell line HEK293T and pancreatic cell line 1.1B4 were determined by luciferase activity. The gene silencing results obtained from siRNA-PLGA nanoparticles produced using three different protocols were not equal. It was determined that the nanoparticles had high encapsulation and loading efficiency, the in vitro release time was optimum, and the prepared siRNA-PLGA nanoparticles caused a complete post-transcriptional silencing of the gene which consequently caused %15 cell death.
Description
Pankreas kanseri hem dünyada hem de Türkiye'de mortalite insidans oranı en yüksek kanser türleri arasında sayılmaktadır. Bu veri var olan tedavi stratejilerinin yeterince etkili olmadığını göstermektedir. Modern yöntemlere rağmen henüz etkili bir ilaç tedavisi geliştirilememiştir. Ayrıca tedavi amaçlı kullanılan kemoterapi ilaçlarının tümörü hedef alamaması ve sağlıklı dokular üzerinde etkili olması; tedavi amaçlı kullanılan radyoterapinin ise radyasyona maruz kalan sağlıklı dokuda fonksiyon kaybı oluşturması gibi bu yöntemlerin çeşitli dezavantajları vardır. Kanser tedavisinde geleneksel tedavi yöntemlerinin yerini, tümöre özgü hedeflenmiş yeni nesil tedaviler almaktadır. Hedefe yönelik tedaviler sağlıklı hücrelere zarar vermediği ve yüksek seçiciliğe sahip oldukları için oldukça ilgi görmektedir. RNA interferans (RNAi) tekniği, çekirdekte DNA tarafından kodlanan çift iplikli mi-RNA'nın tek sarmalının sitoplazmada komplementeri olan spesifik mRNA moleküllerini yıkıma uğratması sonucu, gen ekspresyonunun inhibe edildiği doğal, biyolojik bir süreçtir. Antisense etki gösteren moleküllerin hedef mRNA'ya bağlanması, genin eksprese olmasını engellemektedir. RNAi mekanizmasında, antisens etki gösteren mikroRNA (miRNA), küçük engelleyici RNA (siRNA) gibi çeşitli moleküller kullanılmaktadır. Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküller; biyobozunurluk, yüksek biyouyumluluk, düşük toksisite gibi özellikleriyle kanser teşhis ve tedavisinde kullanılmaktadır. PLGA nanopartiküllerin içerisine yüklenen siRNA ile mRNA düzeyinde etkili gen susturulması mümkündür. GPR87 (G-protein bağımlı reseptör 87) geni, GPCR (G protein-bağlantılı hücre yüzeyi reseptörleri) ailesine dahil hücre yüzey reseptörünü kodlayan gendir. Pankreas kanserinde aşırı eksprese olan GPR87 geni hücrelerin canlılığını devam ettirmede önemli rol oynamaktadır. GPR87 geni, siRNA yüklü PLGA nanopartikülleri kullanılarak genin susturulması hücrelerin yaşam süresini önemli derecede etkilemektedir. Bu çalışmada farklı hücrelerde GPR87 geni PLGA nanopartikülleriyle hedeflenerek, genin RNAi mekanizmasıyla post transkipsiyonel susturulması hedeflenmiştir. Bu amaçla ilk olarak GPR87 geni HEK293T hücre hattından izole edilmiş, izole edilen gene özgü tasarlanan primerler ile genin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR ürünü ve psiCHECK™-2 vektörü XhoI ile kesilerek ligasyonu gerçekleştirilmiştir. GPR87-psiCHECK™-2 rekombinant vektörü E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine transforme edilmiştir. Transformasyon kontrolü PCR, agaroz jel elektroforezi ve biyoinformatik araçlarla kontrol edilmiştir. Daha sonra GPR87 gen dizisine özgü siRNA üretimi gerçekleştirilmiştir. siRNA üretimi ilk önce oligonükleotit template tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan bu template T7 promoter primer ile hibridizasyonu sağlandıktan sonra Klenow DNA polimeraz ile polimerizasyonu gerçekleştirilerek dsRNA elde edilmiştir. Tezin ikinci aşamasında PLGA nanopartiküllerinin sentezlenmesi, karakterizasyonu, optimum salım süresi ve toksisitesi tespit edilmiştir. Bu amaçla ilk önce water-oil-water (W1/O/W2) çift emülsiyon çözücü buharlaştırılması yöntemiyle PLGA nanopartikülleri hazırlanmıştır. Üç farklı formülasyonda nanopartiküller hazırlanmış ve bu nanopartiküllere siRNA yüklenmiştir. Elde edilen siRNA-PLGA nanopartiküllerinin karakterizasyonları gerçekleştirilmiş, enkapsülasyon veriminin (%EE) ve yükleme veriminin (LE) hesaplanmıştır. Ayrıca oluşturulan nanopartiküllerin in vitro salım süreci optimize edilmiş ve sitotoksisitesi ölçülmüştür. Son aşamada ise üretilen nanopartiküller insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293T ve pankreas hücre hattı 1.1B4 hücrelerinde gen susturma oranları lusiferaz aktivitesi ile tespit edilmiştir. Üç farklı protokol kullanarak hazırlanan siRNA-PLGA nannopartiküllerin gen susturma oranlarının farklı olduğu, yüksek enkapsülasyon ve yükleme verimliliğine sahip olduğu, in vitro salım süresinin istenilen düzeyde olduğu ve ayrıca hazrılanan siRNA-PLGA nanopartiküllerinin genin post transkripsiyonel susturulmasını sağlayarak hücre ölümüne neden olduğu belirlenmiştir.
Keywords
Biyoteknoloji = Biotechnology, G proteinleri = G proteins, Gen susması = Gene silencing, Genler = Genes, Glikolik asit = Glycolic acid, Laktik asit = Lactic acid, Nanopartiküller = Nanoparticles, Neoplazmlar = Neoplasms, Pankreas hastalıkları = Pancreatic diseases, Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms, RNA = RNA