Format dehidrogenaz enziminin candida boidinii'den moleküler olarak klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu - Arlı, Nazlı (Bezmialem Vakıf University, 2017)
Enzyme production has an important place in modern biotechnological industry. Factors as expensiveness of enzyme extraction from plantal and animal sources, difficulty of getting standardization in terms of quality and quantity have increased the tendency toward microbial sources. With the development of recombinant DNA technology and its manipulability on microorganisms, the global industrial market for recombinant enzymes was indicated at 4.61 billion dollars in 2016. This market is expected to reach 6.3 billion dollars by 2022 in terms of value, at a compound annual growth rate of 5.8% from 2017. NAD+-dependent formate dehydrogenase (FDH, EC 1.2.1.2) is an enzyme that catalyzes the oxidation of formate ions to CO2 concurrently reduction of NAD+ molecule to NADH. Expensive cofactors like NAD(H) and NADP(H) are needed in reactions where enzymatic reduction is important. Cofactor regeneration methods have been developed on the purpose of offering affordable alternatives. In these methods, FDH is one of the most preferred enzymes thanks to its advantageous properties. No by-product accumulation, inertness to the reaction substrate, suitable thermodynamic equilibrium, wide pH range features raise FDH enzyme into a privileged position. Synthetic production of this enzyme has gained importance in recent years since it is frequently used for the production of optically active compounds in pharmaceutical industry and diagnostic tests in clinical biochemistry laboratories. Studies showed that FDH enzyme can be produced recombinantly from various methylotrophic bacteria and yeasts. In this study, cloning of the gene encoding FDH enzyme from Candida boidinii (C. boidinii) ATCC 18810 yeast strain into Escherichia coli (E. coli) bacterium, expression and characterization of the gene product, FDH enzyme, was aimed. In line with this purpose, first, genomic DNA of C. boidinii was isolated, target gene was amplified with polymerase chain reaction (PCR) and the expected 1104 bp band was seen. Amplified gene was cloned into pTZR57R/T vector via TA cloning method and E. coli One Shot® Mach1™-T1R cells were transformed with the recombinant vector pTZR57R/T+FDH. The vector within the transformed cells was digested with NdeI and BamHI restriction enzymes and the target FDH gene transferred to pET-14b expression vector that was treated with the same restriction nucleases. E. coli One Shot® Mach1™-T1R cells were transformed with the new recombinant vector, pET-14b/FDH. Transformation success was verified with colony PCR, restriction enzyme digestion and sequence analysis. Afterwards, pET-14b/FDH vector was transferred to E. coli One Shot® BL21 (DE3) expression cells. FDH enzyme production was induced with IPTG and produced protein was purified with Ni-NTA affinity column chromatography. SDS-PAGE and Western blot analyzes were carried out to see the presence of FDH protein and both of them displayed expected 41 kDa bands. Finally, enzyme assays were done to determine ideal activity conditions. Results were evaluated by 340 nm wavelength absorbances of enzymatic reaction product, NADH. In consequence of characterization studies, it was determined that recombinant FDH enzyme works efficiently at pH 8.0 Tris buffer solution with 40 mM formate substrate concentration until the temperature reaches 60°C. This enzyme which is frequently used in pharmaceutical industry and clinical biochemistry laboratories is provided from foreign sources in our country thereby it becomes costly. This study is important in the way of providing data for national production of FDH enzyme and starting large scale production in industrial area.
Modern biyoteknoloji endüstrisinde enzim üretimi önemli bir yer tutmaktadır. Klasik yöntemlerle bitkisel ve hayvansal kaynaklardan enzim eldesinin ekonomik olmaması, kalite ve miktar standardizasyonunun yakalanmasının zor olması gibi faktörler mikrobiyal kaynaklara olan eğilimi artırmıştır. Rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesi ve mikroorganizmalarda kolaylıkla manipüle edilmesi ile birlikte rekombinant enzimlerin endüstriyel pazarının büyüyerek 2016 yılında 4.61 milyar dolara çıktığı açıklanmıştır ve 2017-2022 öngörü raporlarına göre %5.8'lik yıllık bileşik büyüme oranı ile 6.3 milyar dolara ulaşması beklenmektedir. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (FDH, EC 1.2.1.2), format iyonlarını CO2'ye yükseltgeyerek NAD+ molekülünü NADH'a indirgeyen bir enzimdir. Enzimatik indirgemenin önemli olduğu reaksiyonlarda NAD(H) ve NADP(H) gibi pahalı kofaktörlere ihtiyaç vardır. Ekonomik alternatifler sunmak amacıyla kofaktörlerin geri dönüştürüldüğü metotlar dizayn edilmiştir. Bu metotlarda; kofaktör geri dönüşümünde hiçbir yan ürün biriktirmeyen, ana reaksiyonun substratına karşı inert olan böylelikle istenmeyen izomerler oluşturmayan, termodinamik denge olarak uygun olan, geniş pH aralığında çalışabilen, ucuz substratlara gereksinim duyan FDH enzimi sahip olduğu bu avantajlı özellikleri ile en çok tercih edilen enzimlerden biridir. Özellikle farmasötikler için önemli olan optikçe aktif bileşiklerin üretiminde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında tanılama testlerinde kullanımından dolayı FDH enziminin sentetik üretimi son yıllarda önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalar, çeşitli metilotrof maya ve bakterilerden FDH enziminin rekombinant olarak üretilebildiğini göstermiştir. Bu çalışmada, Candida boidinii (C. boidinii) mayası ATCC 18810 suşunda FDH enzimini kodlayan gen bölgesinin rekombinant tekniklerle Escherichia coli (E. coli) bakterilerine klonlanması, gen ürünü olan proteinin eksprese edilmesi ve karakterizasyonunun gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda ilk olarak C. boidinii mayasının genomik DNA'sı izole edilmiş, tasarlanan primerler ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirilerek hedef FDH gen bölgesi çoğaltılmış ve beklenen 1104 bp'lik bant görülmüştür. Çoğaltılan gen TA klonlama metodu ile pTZR57R/T vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör pTZR57R/T+FDH ile E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücreleri transforme edilmiştir. Transformasyon gerçekleştikten sonra rekombinant vektör NdeI ve BamHI restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve hedef gen bölgesi ekspresyon vektörü olarak kullanılan pET-14b vektörü ile birleştirilerek E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine aktarılmıştır. Transformasyonun başarısı koloni PCR, restriksiyon enzim kesimi ve dizi analizleri ile onaylanmıştır. Sonrasında elde edilen rekombinant pET-14b/FDH vektörü ile ekspresyon hücresi olarak kullanılan E. coli One Shot® BL21 (DE3) hücrelerinin transformasyonu gerçekleştirilmiştir. FDH enziminin üretimi için gen ekspresyonu IPTG ile indüklenmiş, Ni-NTA afinite kolon kromatografisi ile hücredeki diğer proteinlerden ayrıştırılarak saf bir şekilde eldesi sağlanmıştır. Hedef proteinin varlığını görmek için SDS-PAGE ve Western blot analizleri yapılmış ve beklenen 41 kDa'luk bant görülmüştür. Son olarak FDH enziminin ideal koşullardaki aktivitesini bulmak için testler yapılmış, enzimatik reaksiyon ürününün 340 nm'deki absorbans değerlerine bakılarak değerlendirme yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarının sonucunda; pH 8.0 Tris tampon çözeltisinde, 40 mM format substrat konsantrasyonunda, 60°C'a kadar olan sıcaklıklarda enzimin aktif olarak çalıştığı belirlenmiştir. Farmasötik endüstrisinde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan bu enzim ülkemizde yurtdışı kaynaklardan temin edilmekte ve pahalıya mâl olmaktadır. Bu çalışma, NAD+-bağımlı FDH enziminin yerli olarak üretilmesi ve endüstriyel sahada büyük ölçekte üretime geçilmesi için veri sağlaması açısından önemlidir.
Keywords: Biyoteknoloji = Biotechnology; Escherichia coli = Escherichia coli; Gen teknolojisi = Gene technology; Genetik mühendisliği = Genetic engineering; Genler = Genes; Kandida = Candida; Klonlama = Cloning; Moleküler klonlama = Molecular cloning