LC–MS/MS, NMR, Spektrofotometrik ve Floresan Teknikleri Kullanılarak Biyotinidaz Aktivite Ölçümü İçin Geliştirilen Özgün Sentetik Substratlar - Sarıkaya U.; Selek Ş.; Altun M.; Gören A. C. (My University, 2026)
Klinik açıdan kritik bir enzim olan biyotinidaz (BTD), biyotin geri dönüşümü için temel bir rol oynamakta ve yenidoğanlarda rutin olarak taranmaktadır. Biyotini-PABA tabanlı geleneksel kolorimetrik analizler, sınırlı özgüllük ve nispeten yüksek yalancı pozitiflik oranlarından muzdariptir. Çok disiplinli bir Türk araştırma grubu olarak, BTD aktivite ölçümü için geliştirilen ve valide edilen iki özgün sentetik substratı sunmaktayız: LC-MS/MS ve spektrofotometrik analizlerle uyumlu bir kromojenik substrat olan Biyotini-Ampiron (BAA) ve yüksek hassasiyetli floresan tabanlı tespit için optimize edilmiş bir florojenik substrat olan Biyotini-NIR-NH₂.BAA, salınan biyotin iyonlarının (m/z 245/227) izlendiği LC-MS/MS ve BTD tarafından gerçekleştirilen enzimatik bölünmeyi doğrulayan ~2.2 ppm\"deki karakteristik sinyallerin gözlemlendiği ¹H-NMR yöntemleriyle karakterize edilmiştir. Buna paralel olarak BAA, 505 nm\"de salınan Ampironun spektrofotometrik tespiti yoluyla optik aktivite göstermiş ve kromojenik uygulanabilirliğini desteklemiştir. Ek olarak, Biyotini-NIR-NH₂, 631/705 nm eksitasyon/emisyon maksimumları ile BTD bölünmesi üzerine güçlü bir floresan yanıt sergileyerek florojenik performansını doğrulamıştır.Mevcut BPABA tabanlı analizlerin analitik hassasiyetini aşmak için daha fazla optimizasyon gerekse de, yeni geliştirilen bu substratlar; çoklu platform uyumluluğu, sentetik erişilebilirlik ve düşük arka plan girişimi sunarak önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu çalışma, sentetik kimyanın enzim teşhisine yönelik analitik stratejileri genişletmedeki translasyonel potansiyelini vurgulamaktadır.

Biotinidase (BTD) is a clinically essential enzyme for biotin recycling and is routinely screened innewborns. Conventional colorimetric assays based on Biotinyl‑PABA suffer from limited specificity andrelatively high false‑positive rates. As a multidisciplinary Turkish research group, we report thedevelopment and validation of two novel synthetic substrates for BTD activity measurement:Biotinyl‑Ampyrone (BAA), a chromogenic substrate compatible with LC‑MS/MS and spectrophotometricanalysis, and Biotinyl‑NIR‑NH₂, a fluorogenic substrate optimized for high‑sensitivityfluorescence‑based detection.Biotinyl-Ampyrone (BAA) Biyotinil-NIR-NH2BAA was characterized using LC‑MS/MS, monitoring released biotin ions (m/z 245/227), and ¹H‑NMR,with characteristic signals observed at ~2.2 ppm, confirming enzymatic cleavage by BTD. In parallel,BAA demonstrated optical activity through spectrophotometric detection of released Ampyrone at 505nm, supporting its chromogenic applicability. Additionally, Biotinyl‑NIR‑NH₂ exhibited a strongfluorescence response upon BTD cleavage, with excitation/emission maxima at 631/705 nm, validatingits fluorogenic performance.Although further optimization is required to surpass the analytical sensitivity of establishedBPABA‑based assays, these newly developed substrates represent a significant advancement byoffering multi‑platform compatibility, synthetic accessibility, and low background interference. Together they highlight the translational potential of synthetic chemistry in expanding analytical strategies for enzyme diagnostics.
Keywords: Sağlık Bilimleri; Health Sciences; Klinik Tıp (Med); Clinical Medicine (Med)